生物屋 2024-06-21 15:55 上海
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前言
·细胞可能死于意外细胞死亡(Accidental cell death, ACD)或受控细胞死亡(Regulated cell death, RCD)，ACD是一种生物学上不受控制的过程，而RCD 涉及结构严密的信号级联和分子定义的效应机制。·越来越多的新型非凋亡形式的 RCD 已被发现，并且越来越多地与各种人类病理有关。·在此，回顾了有关非凋亡类型的 RCD 的当前最新进展，包括坏死性凋亡(necroptosis)、细胞焦亡(pyroptosis)、铁死亡(ferroptosis)、细胞内死亡(entotic cell deat)、parthanatos、溶酶体依赖性细胞死亡(lysosome-dependent cell death)、自噬依赖性细胞死亡(autophagy-dependent cell death)、alkaliptosis和oxeiptosis以及其它新发现的死亡方式。
Cell Research. 2019, 29:347–364. https://doi.org/10.1038/s41422-019-0164-5
o核凝集和碎裂：细胞核物质凝聚，并最终分裂成较小的片段。o细胞膜改变：细胞膜的组成发生变化，特别是膜磷脂的外翻，使得细胞被免疫细胞识别并清除。o细胞碎片形成：细胞被切割成多个包含细胞器和细胞核碎片的小体，这些小体被称为细胞碎片或凋亡小体。
o在细胞凋亡过程中，会产生许多种标志性的生理现象。随着凋亡程度的进一步加深，产生的生理现象也各有不同。
o早凋时期：细胞膜结构发生改变，细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻、Bcl-2等凋亡相关蛋白激活、胞内Caspase酶激活、线粒体膜电势崩溃等。
o凋亡中期：亚G1期细胞群增加。
o晚凋时期：细胞核皱缩、DNA片段化、细胞膜出芽，形成凋亡小体。
o细胞凋亡分为外源性和内源性细胞凋亡：
o内源性通路(Intrinsic pathway)：主要通过线粒体受损和氧化应激反应触发。线粒体外膜通透性增加，导致细胞色素C释放到细胞质中。细胞色素C与Apaf-1和ATP结合形成复合物，激活Caspase-9，进而激活Caspase-3等执行酶，引发细胞死亡。
o外源性通路(Extrinsic pathway)：通常由死亡受体(如Fas或TNF受体)的配体结合引发。死亡受体的激活促使凋亡信号复合体的形成，激活Caspase-8。激活的Caspase-8直接激活执行caspases，如caspase-3，或间接通过裂解Bid蛋白介导线粒体路径。
oMG-132：蛋白酶体(Proteasome)抑制剂，有效阻断26S蛋白酶体复合物的蛋白水解活性。MG-132也是自噬激活剂。
oStaurosporine是一种有效，ATP 竞争性的，非选择性蛋白激酶抑制剂。
oZ-VAD-FMK是广谱的Caspase抑制剂，对Caspase家族成员有不同程度的抑制作用。
o以细胞凋亡过程中产生的不同生理变化为依据，可采用不同的检测方法来进行细胞凋亡的检测。
o1) 显微镜观察：显微镜下可观察到细胞凋亡的形态学变化，可通过HE染色、吖啶橙染色、台盼蓝染色通过光学显微镜或者荧光显微镜进行观察，通过颜色或者胞核胞质状态检测细胞凋亡。
oAnnexin V检测细胞膜PS外翻：细胞发生早期凋亡时，细胞膜上的PS外翻。AnnexinV是一种蛋白，可与PS进行结合。当细胞发生凋亡时，可利用连接荧光染料的Annexin V与外翻的PS结合，通过检测荧光基团的信号判定凋亡发生情况。
o检测凋亡过程中激活的蛋白：在细胞膜失去对称性后，细胞内的某些凋亡相关蛋白被激活，如Bcl-2、BAX、FASL/TNFSF6、TNF-α 等，可通过ELISA等方法测定细胞内被激活的蛋白，以判断细胞是否处于凋亡状态。
oCaspase酶活性检测：细胞凋亡早期，存在于细胞质内的Caspase被激活，从而引发一系列凋亡相关级联反应，可通过检测Caspase的活力来判定细胞凋亡情况。
oJC-1检测线粒体膜电位变化：正常细胞线粒体膜电位较高，JC-1可聚集发出红色荧光；当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位降低，JC-1无法聚集，便以绿色单体存在。可通过检测线粒体膜电位变化来判断凋亡发生情况。
oTUNEL检测DNA断裂情况：细胞凋亡晚期，DNA片段化，断裂的DNA暴露出的3’-OH可以被末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化，与荧光素标记的dUTP结合。可通过TUNEL试剂盒检测DNA是否发生片段化，判定细胞凋亡。
o细胞的坏死性凋亡是一个机体主动的、依赖细胞内信号转导的过程，由相应配体通过激活死亡受体而触发。目前认为坏死性凋亡的发生及调控主要与TNFα(肿瘤坏死因子)、Caspase-8、RIPK1(受体相互作用蛋白激酶)、RIPK3和MLKL(混合系激酶区域样蛋白)等蛋白有关。
o其中TNFα是坏死性凋亡最主要的上游信号元件。正常情况下，TNFα、FASL(FAS 配体)和 TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)的信号传导将RIPK1激酶募集到质膜上的细胞凋亡抑制剂(cIAPs)复合物中，从而导致级联反应，使 NF-κB 活化并促进细胞存活。
o当这一过程被阻断时，RIPK1与活化的Caspase-8 等因子形成二级复合物，诱导细胞凋亡。在细胞应激等条件下，Caspase-8活性被抑制，导致坏死小体的形成，RIPK1的调控功能从凋亡转换为坏死性凋亡。
o这导致RIPK1和RIPK3之间一系列的自动和交叉磷酸化，RIPK3的磷酸化导致MLKL的募集和随后的磷酸化，并转移到质膜形成孔复合物。细胞膜破裂后细胞内容物溢出进入器官，导致炎症表型的出现和损伤相关分子模式(DAMP)的释放，如IL-1α、IL-β和IL-33等，从而引发免疫应答，最终导致细胞死亡。
oTNF alpha+ Z-VAD-FMK+ SM-164：TNF alpha激活RIPK1和RIPK3，SM-164是XIAP的拮抗剂，Z-VAD-FMK抑制凋亡。联合处理较单独使用其中一种刺激物对诱导坏死性凋亡的效果更好三种联合处理的试剂也可以用相似功能的试剂代替，比如TNF-α可以换成IFN-γ或TRAIL处理。
oNecrosulfonamide/NSA：选择性靶向MLKL蛋白N端卷曲螺旋结构域，而不影响RIPK3对MLKL的磷酸化。因此使用NSA后，在WB检测中不会明显观察到MLKL的磷酸化水平变化，但细胞死亡率降低。
oNecrostatin 1/Nec 1：抑制RIPK1激酶活性。Necrostatin 1也是一种吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。
oGSK-872：高亲和力结合RIPK3激酶结构域抑制激酶活性。
o1)形态变化：细胞死亡的形态变化是一个动态变化的过程，因此，需要实时“监控”整个过程才能确认坏死性凋亡的发生。延时视频显微镜能够将单个细胞的形态变化与分子、亚细胞和生化事件相关联，从而检测坏死性凋亡(但此方法成本较高且比较耗费人力)。
o2)抑制和敲除：坏死性凋亡的抑制剂——RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 和 MLKL 抑制剂 Necrosulfonamide 来阻断坏死性凋亡，测定细胞的存活率，反向验证坏死性凋亡的发生。但是抑制剂能在某些细胞中诱导细胞凋亡，在区分坏死性凋亡和凋亡方面不够特异。因此，需要通过敲除关键蛋白(如RIPK3或MLKL阻断坏死性凋亡)，补充抑制实验的证据。
o3)关键蛋白质检测：用WB、IHC或流式细胞仪来检测坏死性凋亡途径中的关键蛋白质如RIPK3、RIPK1和MLKL的变化。磷酸化MLKL (Ser358 和 Thr357) 是最常见的检测蛋白，可确认坏死性凋亡是通过RIPK3介导的MLKL激活。此外，RIPK1/ pro-caspase-8 的高比例也说明了环境有利于坏死性凋亡。
·坏死(Necrosis)是极端的物理、化学或其他严重的病理性因素(例如缺氧、冷冻或燃烧、某些病原体、物理化学应激(例如H2O2)、缺血再灌注和钙过载)诱发的细胞死亡，是病理性细胞死亡。·细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式，具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补”方式被采用。·在许多病理条件下都观察到坏死，包括心肌梗塞、中风、几种神经退行性疾病和某些癌症，其中坏死的恶性细胞释放的因子可能会影响肿瘤微环境。
o其特征是细胞肿胀、膜完整性丧失、细胞内内容物(DAMPs和PAMPs)“溢出”到细胞外环境和离子梯度消散，坏死的早期事件包括细胞内Ca2+浓度增加和活性氧物质的产生最终导致不可逆细胞损伤的事件。
o细胞膨胀：坏死细胞体积增大，这是由于细胞膜完整性受损，导致细胞无法维持电解质平衡。
o细胞溶解：细胞内容物泄漏到周围组织中，这可能包括酶和其他细胞组分，这些泄漏的内容物可以损害邻近的细胞并触发炎症。
o细胞核变性：细胞核可能发生崩解(karyolysis)、凝固(pyknosis)或碎片化(karyorrhexis)。
o缺乏典型的凋亡体(apoptotic bodies)形成：与凋亡不同，坏死不涉及细胞碎片的有序包装和清除。
o细胞核的改变：这是细胞坏死的主要形态标志，表现为核浓缩，核碎裂，核溶解；
o细胞质的改变：由于胞质发生凝固或溶解，HE染色呈深红色颗粒状，如肝细胞坏死出现的嗜酸性小体；
o间质的改变：由于各种溶解酶的作用，基质崩解、胶原纤维肿胀、断裂或液化，与坏死的细胞融合成一片，呈红染的颗粒状无结构物质。
o细胞坏死依据组织内蛋白质变性不同可分为以下几种类型：
o1)凝固性坏死：凝固性坏死是指局部组织细胞死亡后表现的干性状态，也称为缺血性坏死，这些组织细胞由于失水、蛋白质凝固，而形成干燥的凝固体。凝固性坏死中也有一些特殊的类型，比如干酪样坏死，常是结核杆菌感染引起，由于结核杆菌的作用，导致组织坏死以后呈黄色、软软的干酪样状态；
o2)液化性坏死：是组织细胞死亡后表现出一种液化性状态，称为液化性坏死，多见于含有蛋白质比较少、脂肪或者水分比较多的组织，坏死以后容易发生溶解、液化。脂肪坏死也是一种液化性坏死，主要是由于脂肪细胞的崩解、坏死而呈液态；
o3)纤维素样坏死：这种坏死只有在医学显微镜下才可以看到，表现为坏死以后的小条或者小块状无结构的组织，性状像纤维蛋白一样，因此称为纤维素样坏死；
o4)坏疽：坏死的组织细胞继发细菌感染，导致这些坏死组织呈现黑色、暗绿色的形态。坏疽包括干性坏疽，也就是凝固性坏死，还有的呈湿性坏疽，类似于液化性坏死。还有些坏疽会产生大量气体，称为气性坏疽，这种气性坏疽往往是在液化性坏死的基础上形成，属于特殊湿性坏疽的类型。
o首先需要判断细胞膜是否破裂，检测方法包括：
o1)形态学观察：透射电镜或扫描电镜观察，如果有一个个膜完整的小体，那就是凋亡；如果细胞膜破裂，那就是坏死。
o2)免疫荧光或流式方法：PI或7-AAD染色，因为PI、7-AAD可以与DNA结合，如果细胞膜破裂，染料就可以进入细胞内，从而发荧光。
o3) 再通过诱因判断是程序性坏死还是被动的细胞坏死，如果是物理因素，比如极端环境，那就是被动的细胞坏死。
4. 自噬依赖性细胞死亡(Autophagy-dependent cell death)·细胞自噬(Autophagy)是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器在自噬相关基因(Autophagy associated gene, Atg)的调控下被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解的过程。正常的动物细胞为了维持细胞内环境的动态平衡，需要不断降解功能失常或不需要的细胞结构，通常寿命较短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径进行降解，而寿命较长的蛋白质及细胞结构则通过自噬途径由溶酶体降解。·目前的自噬可分为三类，包括巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)，其中巨自噬是最主要，也是研究得最多的形式。
o细胞自噬的过程不是一个完全被动的细胞学过程，而是细胞自身在受到外界的刺激通过一系列的细胞内信号转导，触发的一系列细胞维持内环境稳定的一种主动的生物学过程。
o细胞自噬的过程主要包括隔离膜(Phagophore)的形成、扩展、自噬体(Autophagosome)的形成、自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体(Autophagolysosome)，自噬溶酶体形成后，内含物被溶酶体中的水解酶消化。
o完整的自噬发生过程大体分为以下4个阶段：自噬的起始→隔离膜和自噬体的形成→自噬体与溶酶体融合→自噬体的裂解。
o自噬依赖性细胞死亡是由自噬分子机制驱动的一种RCD，其特征是自噬空泡化。
oTat-Beclin 1诱导自噬依赖性细胞死亡的发生，该分子是一种自噬诱导肽，融合了 BECN1和 HIV Tat 的蛋白氨基酸。该过程可以通过阻断Tat-Beclin 1上游的Na+/K+-ATP酶来抑制。
o自噬依赖性细胞死亡可能在神经毒性和缺氧缺血诱导的神经元死亡中起重要作用，提示这种类型的 RCD 可能作为神经保护的靶点。
oRapamycin：通过抑制mTOR的活性达到诱导自噬的作用。
oChloroquine：处理会增加自噬体结合的LC3-II和p62，抑制自噬体降解。自噬体积累会阻止受损细胞内细胞器和蛋白质的清除，最终导致细胞死亡。Chloroquine也是Toll样受体(TLRs)的抑制剂。经过Chloroquine处理的细胞可明显看到p62的聚集。
oBafilomycin A1/BafA1：是特异性、可逆的V-ATPase抑制剂。Bafilomycin A1阻断自噬体与溶酶体的融合。
o检测自噬水平的方法主要有三种：电镜观察、Western Blot检测和荧光蛋白标记检测。
o1) 电镜观察：透射电子显微镜检测自噬基于辨认自噬体结构，是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。
o2) Western Blot：(1) 自噬过程中，LC3在合成后其C端被切割变成LC3-Ⅰ，散在分布于胞浆内；当自噬体形成LC3-Ⅰ后，与磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-Ⅱ，定位于自噬体内膜和外膜，并且始终稳定保留，直到与溶酶体融合。因此可利用WB检测LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化以评估自噬的强弱。(2) p62作为自噬的重要受体，主要依赖于自噬途径进行降解。因此，p62的蛋白水平也常用来指示自噬的降解情况。
o3) 荧光蛋白标记：(1) GFP-LC3：无自噬时，GFP-LC3在胞浆中弥散分布；自噬形成时，GFP-LC3聚集于自噬体膜上。在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量。自噬体内膜上的LC3在溶酶体中被降解，因此，LC3的整体降解量可以通过GFP-LC3荧光的降低进行流式细胞仪定量检测。(2) RFP-GFP-LC3 双荧光指示系统：溶酶体内的酸性环境导致GFP荧光信号淬灭，而红色荧光蛋白对酸性环境具有很好的耐受性，可以构建RFP-GFP-LC3串联体。自噬形成时，自噬体呈黄色标记(绿色和红色图像重合)，自噬溶酶体呈红色标记。
·细胞焦亡(Pyroptosis)又称炎症程序性细胞死亡，是一种依赖于Gasdermin家族蛋白形成质膜膜孔的可调控的细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放大量炎症因子进而激活强烈的炎症反应。·细胞焦亡是由炎性小体激活引起的，是机体一种重要的天然免疫反应，在炎症、免疫和抗击感染中中起着重要的作用。
o光镜下焦亡细胞表现为细胞肿胀膨大，并且有许多气泡状突出物(焦亡小体)。
o细胞发生焦亡时，细胞会发生肿胀，在细胞破裂之前，细胞上形成凸出物(图A)，之后细胞膜上形成孔隙，使细胞膜失去完整性，释放内容物，引起炎症反应，此时，细胞核位于细胞中央(图B)，随着形态学的改变，细胞核固缩，DNA断裂。
o可分为经典途经和非经典途经。
o经典途径：又叫Caspase-1依赖途径，在此途径中，NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin等炎症小体被激活后，将活化并裂解Pro-Caspase-1，形成具有活性的Caspase-1。活化的Caspase-1一方面切割GSDMD，形成含有GSDM-NT活性域的肽段，诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，释放内容物，引起炎症反应；另一方面，活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应。
o非经典途经：在受到脂多糖(LPS)刺激后，Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可以与LPS直接结合并启动焦亡进程。一方面，活化的Caspase-4/5/11可以裂解GSDMD蛋白，GSDMD蛋白N端既可以介导细胞膜溶解与细胞焦亡；另一方面，活化的Caspase-4/5/11激活NLRP3炎症小体来活化Caspase-1，最终产生IL-1β和IL-18并外释。
o炎性小体可以分为典型的Caspase-1依赖性炎症小体和非典型的Caspase-11依赖性炎症小体。
o典型的Caspase-1依赖性炎症小体可以被病原体相关分子模式(PAMPs)，损伤相关分子模式(DAMPs)或其他免疫反应选择性激活。
o非典型的Caspase-11依赖性炎症小体由巨噬细胞、单核细胞或其他细胞细胞质中的LPS激活，该过程不依赖细胞膜的TLR4受体。
oGSDMD被Caspase-11或Caspase-1切割产生22kDa C末端片段(GSDMD-C)和31kDa N末端片段(GSDMD-N)；GSDMD-N产生后立即移位到质膜的内部小叶与磷脂结合，诱导孔的形成，最终导致细胞膜裂解，而GSDMD-C抑制GSDMD-N的这一活性。
oLPS：参与非经典细胞焦亡途径，激活Caspase 4/5裂解GSDMD。
oNigericin Sodium/Nig：Nigericin sodium salt是从吸水链霉菌中得到的一种抗生素，NLRP3炎症小体激活剂。如下图，Nigericin Sodium salt处理细胞导致细胞焦亡，甘氨酸是一种细胞保护剂，可防止焦亡细胞裂解，但不能防止GSDMD孔的形成，也不影响IL-1α和IL-1β的成熟。
oRaptinal：直接激活Caspase-3并在多个细胞系中启动内在的Caspase依赖性凋亡途径。
oDisulfiram：有效抑制GSDMD孔形成从而抑制细胞焦亡。
o1) 形态学观察：光镜下焦亡的细胞发生肿胀，有许多气泡状突出物。
o2) RT-qPCR检测焦亡相关指标mRNA表达：常用指标包括Gsdmb、Gsdmc、Gsdmd、Gsdme、Caspase1/4/5/11等。
o3) 免疫法(WB/IHC)检测焦亡相关指标蛋白表达：常用指标包括GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、Caspase1/4/5/11等。
o4) ELISA检测炎症因子：常用指标包括IL-1β，IL-18等。
o5) 检测LDH释放验证细胞是否渗漏：焦亡的细胞因质膜穿孔而发生渗漏，胞内物质流出，包括LDH。LDH活性稳定，易于检测，通过检测LDH可评估细胞渗漏程度。
o6) Caspase试剂盒检测相关Caspase酶的活化：相关指标包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11等。
o细胞内铁和脂质过氧化的积累，导致氧化损伤并最终破坏细胞膜。
o主要分为GPX4调节途径、铁代谢途径和脂质代谢途径。
oGPX4通过限制脂质过氧化物和活性氧(ROS)来有效抑制铁死亡。
o其主要特征为：线粒体变小，膜密度增高，嵴减少，细胞核形态变化不明显；脂质过氧化增高，在铁离子催化作用下，活性氧(ROS)升高，胞内氧化还原失衡，释放前炎症介质。
o铁依赖的脂质过氧化：铁死亡的核心特征是细胞内脂质过氧化物的积累，特别是多不饱和脂肪酸(PUFAs)的脂质过氧化。这是因为铁(Fe2+)通过Fenton反应催化产生自由基，这些高活性的自由基攻击细胞膜上的脂质，导致膜的结构破坏。
o抗氧化防御系统的失效：细胞通常通过谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)等抗氧化系统来抵御脂质过氧化。在铁死亡中，这些防御机制无法正常工作，特别是GPX4的活性受到抑制或失活，使得细胞不能有效地清除脂质过氧化物。
o细胞膜的完整性受损：脂质过氧化导致的细胞膜损伤是铁死亡的直接后果。细胞膜的结构和功能障碍使得细胞无法维持正常的代谢和生理状态，最终导致细胞死亡。
o典型的GPX4通路：谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)是一种硒蛋白，在铁死亡过程中起着主要调节作用，其独特的功能是通过将脂质氢过氧化物转化为无毒的脂质醇来中断脂质过氧化，谷胱甘肽(GSH)的生物合成和GPX4的正常功能是控制铁死亡的核心，抑制GPX4可增加细胞铁死亡的敏感性。铁的积累会产生特定的磷脂氢过氧化物，这些氢过氧化物会通过xc-/GSH/GPX4轴被细胞内源性地抵消。胱氨酸被xc系统吸收后，还原成半胱氨酸合成GSH，维持GPX4的活性。如果该过程的任何一步被破坏，GPX4的活性就会降低，导致细胞内过氧化物的积累，从而导致铁死亡。
o不依赖GPX4的铁死亡途径：在抗铁死亡细胞系MCF-7的研究中，研究人员筛选了GPX4缺失的互补基因，发现了AIFM2基因，该基因最初被发现可诱导细胞凋亡，研究人员将其命名为FSP1，此后，一些研究证明FSP1可以抵抗铁死亡(Ma et al., 2022)。研究发现，FSP1在GPX4敲除细胞中过表达也能显着减少磷脂过氧化产物，从而抑制铁死亡的发生，说明FSP1的抗铁死亡作用不依赖于GPX4的表达。随着发现FSP1可以独立于GPX4调节铁死亡，研究人员更加热衷于寻找不依赖GPX4 的铁死亡途径。ALOX和iPLA2β、iNOS、GCH1、DHODH、Prominin2、MUFA以及其他受FSP1和p53调节的途径已被发现。
oErastin：结合且抑制电压依赖性阴离子通道(VDAC2/VDAC3)；能够通过直接抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统Xc-活性来降低谷胱甘肽(GSH)水平。
oRSL3：是GPX4的抑制剂，可直接作用于GPX4使其失活，从而诱导脂质过氧化产生ROS。
oFerrostatin-1：抑制Erastin诱导的HT-1080细胞铁死亡。Ferrostatin-1是一种人工合成的抗氧化剂，通过减轻铁死亡来减少细胞死亡。
o铁死亡的判断与检测，可以通过四个方面进行检测：相关基因检测，相关蛋白检测，细胞形态检测，代谢检测，这些检测指标包括各个调控途径的关键基因及铁死亡的特征指标。
o细胞形态检测：主要通过电镜检测线粒体的形态变化和细胞膜的完整性。
o相关基因的检测：如GSH稳态调节基因、CHAC1的上调，NFE2L2基因的激活等。
o相关蛋白的检测：如CHAC1蛋白的上升，GPX4蛋白的降低等。
o相关代谢的检测：如细胞活性的变化，铁/亚铁离子的细胞内变化，ROS、过氧化氢等氧化物质的增加，脂质过氧化产物(如MDA、LPO等)的增加。
v亚铁离子检测：细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一，亚铁离子积累可以特异性地增加氧化应激水平，所以可用FerroOrange 染细胞。
vROS检测：细胞内会由于铁的积累而抑制抗氧化系统，铁可能直接通过 Fenton 反应产生过量的 ROS，从而增加氧化损伤。所以可用ROS 检测。
v脂质过氧化物：铁死亡的脂质过氧化的指标还有谷胱甘肽(GSH) 合成的变化、脂质过氧化物(MDA, LPO) 水平的变化，因此可检测脂质过氧化物这些指标。
v谷胱甘肽代谢
v铁死亡相关蛋白表达：WB检测与铁死亡相关的蛋白表达，如PTGS2、NOX1、FTH1、COX2、GPX4、ACSL4等，其中COX2、ACSL4、PTGS2、NOX1在铁死亡细胞中表达上调，GPX4，FTH1在铁死亡细胞中表达下调。
o铜死亡是一种发生机制明显区别于已知的细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡及铁死亡的受控性细胞死亡方式，主要特征是细胞铜含量的增加，其诱导的死亡可以被铜离子载体诱导和铜螯合剂抑制，但不能被其他细胞死亡抑制剂抑制。
o铜死亡依赖于细胞内铜离子的积累，铜离子直接结合三羧酸循环(TCA)中的脂酰化成分，导致这些蛋白聚集、失调，阻断了三羧酸循环(TCA)，Fe-S簇蛋白的丢失，从而引起蛋白毒性应激反应并导致细胞死亡。FDX1是铜死亡的关键调控因子，也是蛋白质脂酰化的上游调节因子。
o作为一种新发现的细胞死亡方式，已发现有些铜死亡的调控涉及铜代谢、线粒体功能及蛋白质修饰。其中FDX1和DLAT蛋白质脂酰化，是诱导铜死亡的关键因子。过量的铜促进了脂酰化蛋白的聚集和功能缺失，引发铁硫簇蛋白的不稳定，导致蛋白质毒性应激，并最终致使细胞死亡。
o铜离子的还原：线粒体基质还原酶ferredoxin 1 (FDX1) 催化ES-Cu2+还原为Cu+，释放到线粒体中。
o亚铜离子与脂酰化蛋白结合：从而诱导脂酰化蛋白的聚集(DLAT二硫键的形成)并抑制线粒体代谢功能，从而促进细胞发生铜死亡。
oElesclomol/ES：是一种有效的铜离子载体。FDX1作为Elesclomol的直接结合剂发挥作用。
oGlutathione/GSH：作为一种含硫醇的铜螯合剂，可阻止铜死亡。
o铜死亡的判断与检测，可以通过四个方面进行检测：相关基因检测，相关蛋白检测，细胞形态检测，代谢检测，这些检测指标包括各个调控途径的关键基因及特征指标。
o1) 细胞形态检测：检测线粒体的形态变化和细胞膜的完整性。
o2) 相关基因的检测：如FDX1、LIAS、SLC31A1。
o3) 相关蛋白的检测：如DLAT、Fe-S、HSP70。
o4) 相关代谢的检测：如细胞活性的变化；铜离子的细胞内指标变化，如OCR、αC酮戊二酸、丙酮酸等。
8. 溶酶体依赖性细胞死亡(Lysosome-dependent cell death)
o触发溶酶体细胞死亡的条件：如细胞内应激、代谢异常和DNA损伤等或者某些毒素、药物和重金属，可以通过影响溶酶体的稳定性和功能，或者破坏溶酶体膜的完整性来激活溶酶体细胞死亡。当细胞暴露于溶酶体洗涤剂、二肽甲酯、脂质代谢物和ROS时，溶酶体破裂，继而释放大量的水解酶，导致LCD的发生。
o溶酶体膜完整性的丧失：在溶酶体细胞死亡中，溶酶体膜的破裂导致其含有的消化酶释放到细胞质中，这些酶会开始消化细胞内的其他组分，导致细胞结构的破坏和细胞死亡。
o细胞内容物的泄漏：溶酶体内的消化酶进入细胞质可以迅速引发细胞结构的分解，包括细胞骨架和细胞膜等。
o激活次级信号途径：溶酶体酶的释放可以触发其他细胞死亡途径，如凋亡和坏死的信号途径，增加细胞死亡的复杂性和多样性。比如组织蛋白酶Cathepsins的释放会通过切割Bid蛋白并降解抗凋亡的Bcl-2同源蛋白，激活了溶酶体凋亡途径。
o溶酶体膜透化还可以在细胞凋亡、自噬依赖性细胞死亡和Ferroptosis的情况下放大细胞死亡信号传导，从而增加了细胞死亡途径的复杂性。
·双硫死亡(Disulfidptosis)是一种由过量胱氨酸积累引起的二硫化物应激(Disulfide stress)导致的新型细胞死亡类型，在2023年3月《Nature Cell Biology》杂志上的研究论文Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis中被首次报道。·研究发现，葡萄糖匮乏诱导的SLC7A11高表达癌细胞的细胞死亡不属于任何一种已知的细胞死亡类型，这种新的细胞死亡类型不能被一般用于抑制细胞死亡的药物抑制，也不能通过敲除铁死亡/细胞凋亡关键基因来阻止，而硫醇氧化剂(如二酰胺和马来酸二乙酯)则可以显著增强这种细胞死亡，因此这种细胞死亡形式被命名为双硫死亡。·进一步研究发现，双硫死亡的主要原因是NADPH的供应不能满足细胞将胱氨酸还原成为半胱氨酸的过程，造成二硫化物应激，诱导肌动蛋白细胞骨架蛋白二硫键形成、细胞骨架收缩以及与细胞质膜的剥离，并最终导致细胞死亡，细胞葡萄糖摄入不足和胱氨酸摄入过量都可能诱导双硫死亡。
o双硫死亡是一种通过氧化还原反应和二硫键形成触发细胞死亡的程序性细胞死亡方式，双硫死亡涉及到的调控途径有胱氨酸摄取和葡萄糖代谢途径，可由胱氨酸转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11，也称为xCT)、NCKAP1等蛋白质和二硫还原剂、2-DG等化合物调节，其中主要的关键因子是SLC7A11。
oSLC7A11的作用是将胞外胱氨酸装运到细胞内。胱氨酸是一种不溶性氨基酸，为了防止细胞内高度不溶性胱氨酸的毒性积聚，细胞需要迅速将胱氨酸还原为半胱氨酸，而这个过程需要从葡萄糖-戊糖磷酸途径(PPP)获得大量NADPH，这会对细胞NADPH库造成大量消耗，并使此类细胞产生葡萄糖和戊糖磷酸途径(PPP)依赖性。
o当细胞存在SLC7A11高表达时，会引起胱氨酸摄取增加，进而引起NADPH供应不足，最终可能导致细胞死亡。
oBAY-876：是一种GLUT抑制剂，选择性的抑制葡萄糖转运蛋白 1 (GLUT1)，对GLUT1的抑制效果是 GLUT2，GLUT3 和 GLUT4 的 130 倍以上。通过抑制葡萄糖摄入，从而诱导双硫死亡。
oDTT：是一种还原剂，还原二硫键，降低二硫化物的积累，抑制双硫死亡。
o双硫死亡的特征有胱氨酸增加、双硫分子增加、细胞收缩和 F-肌动蛋白收缩等，根据这些特征，可以通过四个方面进行检测：代谢检测、形态检测、蛋白检测和基因检测。
o1) 代谢检测：NADPH、ATP、胱氨酸摄取、葡萄糖、Trx等。
o2) 形态检测：染色检测肌动蛋白丝的形态。
o3) 蛋白检测：GLUT1、GLUT3、HK2、LDHA、SLC7A11。
o4) 基因检测：GSTT1、MYH9、NCKAP1、RPN1。
·泛凋亡(PANoptosis)是2019年由美国学者Malireddi提出的一种全新程序性死亡方式，泛凋亡受到PANoptosome(泛凋亡体)复合物的调控，具有细胞焦亡(Pyroptosis)、凋亡(Apoptosis)和/或坏死性凋亡(Necroptosis)的关键特征，这也是PANoptosis术语中“P”、“A”和“N”的来源，但泛凋亡却不能用这3种程序性细胞死亡(PCD)途径单独解释。·以往的研究中，一般认为凋亡、焦亡、坏死性凋亡三者都是独立运行的，但是随着研究的深入，越来越多的研究结果表明这三者之间存在着某种串扰，它们之间可以相互交叉调节。如：凋亡执行者Caspase-3和Caspase-7可以通过氨基端分裂灭活GSDMD，还可以裂解GSDME，使细胞死亡的形态由凋亡转变为焦亡；坏死性凋亡的执行和MLKL孔的形成可通过膜损伤激活细胞凋亡，这些发现促成了PANoptosis(泛凋亡)概念的建立。
o泛凋亡受到上游感受器和分子信号的级联调控，这些传感器和级联信号组装成一种多聚体复合物，即泛凋亡小体(PANoptosome)。
o作为下游分子的激活平台和启动3种PCD途径的“总开关”，PANoptosome及其上游的感受器为人类疾病的治疗提供了颇具吸引力的干预靶点。
o已经明确的泛凋亡上游分子有三种，分别是 ZBP1、RIPK1 和 AIM2，它们可以感受特定刺激并触发泛凋亡小体的组装，形成三种具有不同传感器和调节因子的泛凋亡小体，即 ZBP1-PANoptosomes、AIM2-PANoptosomes 和RIPK1-PANoptosomes。
o1) 观察细胞形态：细胞焦亡引起细胞质肿胀和膜破裂；凋亡主要形态学特征包括染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。
o2) 检测不同PCD 的关键蛋白：焦亡相关包括Caspase-1、Caspase-4、GSDMD、AIM2/Pyrin/NLRP3 等，凋亡相关包括Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、PARP、Bax/Bcl 等，坏死性凋亡相关包括MLKL、RIPK1、RIPK3、ZBP1等。
o3) 其他检测方法：Annexin V、TUNEL、JC-1等方法检测凋亡；ELISA 检测炎症因子的释放；免疫印迹、流式等技术检测炎性小体NLRP3 表达和Caspase活化情况。
11. 中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps, NETosis)·中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps, NETosis, 也称Netotic cell death)是一种由中性粒细胞在炎症状态下引发的特殊类型的细胞死亡(只发生在中心粒细胞中)，它主要功能是通过释放包含DNA、组蛋白和抗菌蛋白的网状结构——中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，来捕获和中和入侵的病原体。这种机制对于身体的先天免疫防御极为重要，因为它帮助限制病原体的扩散并促进其清除。
o由于病原体的刺激，Necroptosis的起始依赖于细胞质中 Ca2+ 浓度的增加和随后的 ROS 产生。
o细胞核和细胞结构的改变：在NETosis过程中，中性粒细胞的细胞核会失去多分叶特征，细胞核和细胞器如线粒体的膜解体，使得DNA和细胞核内容物散布到细胞质中。
o染色质的解压和外露：中性粒细胞中的PAD4入核，催化组蛋白的瓜氨酸化，导致染色质解凝，同时组蛋白还会发生乙酰化。中性弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G、嗜天青素和过氧化物酶(MPO)也会释放到细胞质中，有助于染色质的解凝和核膜的分解。
oNETs的形成和释放：混合了抗菌蛋白的解压DNA从破裂的细胞膜中释放到胞外，形成网状结构即NETs，用于捕捉和中和病原体。
oNETs是一种解聚DNA组成的长丝状细胞外网状结构，与瓜氨酸组蛋白H3、中性粒细胞弹性酶(NE)、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶(MPO)共同构成。
o细菌(如肺炎链球菌、大肠杆菌、结核分枝杆菌、粘质沙雷氏菌)；
o细菌衍生成分(如脂多糖、N-甲酰基蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸、葡萄糖氧化酶、金黄色葡萄球菌白毒素)；
o牙周细菌(如：具核梭菌、牙龈假单胞菌、链球菌、放线菌)；
o真菌、寄生虫、原生动物(如白色念珠菌、曲霉菌、隐球菌)；
o病毒(如甲型流感、人类免疫缺陷病毒1型、与严重急性呼吸系统综合症相关的冠状病毒)；
o宿主衍生介质(如血小板、血小板活化因子、一氧化氮、抗体、IL-1β、GM-CSF+C5a、LL-37)。
o1)激活中性粒细胞：NETs的形成可以通过上文的刺激源激活各种表面受体而触发，如细胞因子受体、Fcγ受体(FcγRs)、Toll样受体(TLRs)、损伤相关分子模式(DAMP)受体、补体受体(如C5aR)和A1或A3腺苷受体；受体激活后会导致细胞内Ca2+浓度的增加；高浓度的钙离子引起蛋白激酶C(PKC)的激活，诱导中性粒细胞通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶-2 (NOX2)或线粒体功能障碍产生ROS。
o2)核膜破裂：核膜是DNA释放到核外的第一个物理屏障。当核膜被蛋白水解或磷酸化分解时，核膜发生破裂；PKC-α介导的层粘连蛋白B磷酸化和分解是核膜破裂的原因。ROS引起中性粒细胞颗粒中的髓过氧化物酶(MPO)和NE的释放，并调节细胞骨架动力学。同时中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)可以激活Gasdermin-D(GSDMD)在核膜和胞膜上形成孔洞。
o3)染色质解聚，染色质和细胞质蛋白颗粒的混合：核膜破裂后中性粒细胞颗粒中的抗菌蛋白与细胞核DNA混合；细胞周期蛋白CDK4和CDK6被激活；ROS激活肽精氨酸脱亚胺酶4 (PAD4)，通过将精氨酸转化为瓜氨酸来减少组蛋白的正电荷及其与DNA的静电相互作用。PAD4的组蛋白瓜氨酸化、中性粒细胞弹性酶(NE)的组蛋白裂解和髓过氧化物酶(MPO)共同介导染色质的解聚。
o4)质膜破裂：NE激活Caspase11，Casepase11与膜上的GSDMD结合，使细胞质膜完整性丧失，NETs释放到胞外空间。
oLytic NETosis(溶解/自杀型)：细胞死亡途径，自杀性NETosis是最经典的一类，同上面形成过程中介绍的一样。它开始于中性粒细胞内肌动蛋白细胞骨架结构的分解，随后组蛋白瓜氨酸化促进染色质解聚，解聚的染色质与细胞质颗粒成分混合。这个过程在质膜破裂时达到高潮，将中性粒细胞陷阱释放到细胞外环境中。
oVital NETosis(非溶解性NETosis)：不伴随细胞死亡，NETs从中性粒细胞中挤出，同时保持膜的完整性。这种非溶解性NETs形成模式维持了中性粒细胞完成吞噬的功能，使它们能够参与微生物吞噬并在释放NETs的同时为宿主防御发挥作用。
o上游调控：NETosis是由微生物和内源性刺激触发的，通过几种激活分子，如高级糖基化终产物受体(RAGE)、P-选择素糖蛋白配体1(PSGL1)、Toll样受体(TLR)、低亲和力免疫球蛋白γ受体(FcγR)或唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglec)等。
v胆固醇和尿酸钠晶体可通过RIPK1-RIPK3-Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein (MLKL) 信号通路，以依赖ROS和NE的方式引发NETosis。v核糖核蛋白免疫复合物通过I型干扰素(IFN)引发的FcγRIIa介导的受体信号通路引起NETs形成。v一些促炎细胞因子如白细胞介素-17A (IL-17A)、肿瘤坏死因子-α、IL-1β和中期因子(midkine)以NADPH氧化酶依赖的方式诱导NETs形成。v血小板来源的警报素，如HMGB1，可以通过高级糖基化终产物受体(RAGE)介导细胞间信号传导，触发MLKL介导的NETs释放，导致静脉血栓形成。vLPS激活的血小板通过TLR4诱导NETs的释放。血小板还可通过Tlr7诱导NETosis释放。v在肝素诱导的血小板减少症/血栓形成中，IgG与肝素/血小板因子4复合物结合可通过与FcγRIIa结合引发NETosis。v吞噬受体，如Dectin-1，在摄取小颗粒时抑制染色质解聚。其他抑制NETosis的受体是白细胞信号抑制性受体-1(signal inhibitory receptor on leukocytes-1, SIRL-1)和唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素5 (Siglec-5)和Siglec-9。
oROS作为连接上游调控途径和驱动NETosis机制的核心
v上游触发ROS产生后，ROS引起嗜天青颗粒复合体(azurosome complex)释放NE，这一过程由GSDMD辅助，GSDMD被caspase-11激活。GSDMD参与了NE从颗粒中释放及其核转运。反过来，NE也可以促进GSDMD在核膜、颗粒膜和质膜中形成孔。v这一过程无论是对于核膜、质膜破裂还是染色质解聚都必不可少，属于核心环节。
o其他的NETs调控
vNETosis还依赖于细胞周期周期蛋白依赖性激酶4/6 (CDK4/6)、中心体复制和自噬。vROS促进DNA损伤，通过共济失调毛细血管扩张突变(ATM)和乳腺癌基因(BRCA)-1触发DNA修复。DNA修复促进了染色质的解聚，并与层粘连蛋白的分解一起产生物理压力，促进核膜的扩张和分解。vMPO或DEK的结合以及PAD4介导的组蛋白瓜氨酸化也会增强染色质的解聚。
oNADPH氧化酶介导的ROS产生；
o自噬；
o颗粒酶的释放和转运；
oCathelecidin家族多肽从细胞质到细胞核的易位。
oNETosis介导组蛋白瓜氨酸化，最终导致染色质去浓缩、核膜破坏和染色质纤维的释放。
oAIFM1依赖型Parthanatos：活化的PARP1结合AIFM1，介导AIFM1从线粒体移位到细胞核，继而导致部分染色体的溶解。
oAIFM1非依赖型Parthanatos：在某些条件下可发生，如干性黄斑变性。
oAIFM1依赖性和非依赖性parthanatos与其他RCD(如自噬依赖性细胞死亡和坏死性凋亡)之间的相互影响可能涉及DNA损伤相关的疾病，如神经退行性疾病，心肌梗塞和糖尿病。
·Entotic cell death是细胞“同类相食”的一种，一个细胞吞噬并杀死另一个细胞，其特征是细胞内细胞结构。Entotic cell death激活后通过LC3相关的吞噬作用(LAP)和组织蛋白酶B(CTSB)介导的溶酶体降解途径吞噬和杀死同类细胞。·细胞粘附和细胞骨架重排通路(如肌动蛋白、肌球蛋白、RHOA和ROCK)在控制Entotic cell death诱导作用中起重要作用。·除细胞粘附和细胞骨架重排途径外，其他信号分子和调节因子(如CDC42)也通过不同的机制参与Entotic cell death的调节。
·Alkaliptosis是一种由暴露于碱性剂，如氨、氢氧化钠或高pH缓冲液触发的新发现的调节性坏死形式，主要是通过NF-κB途径的上调和随后的碳酸酐酶9(CA9，这个酶能够调节PH值)的下调来激活。·Alkaliptosis的具体分子作用机制仍不清楚。
·氧死亡(Oxeiptosis)是氧自由基诱导的不依赖半胱天冬酶的新型RCD，该过程由KEAP1-PGAM5-AIFM1途径驱动。·这种细胞死亡形式主要通过KEAP1/PGAM5/AIFM1信号通路调控，从而保护机体免受ROS和炎症的影响。过度活化的KEAP1可以NFE2L2非依赖性方式介导H2O2诱导的Oxeiptosis，通过KEAP1-PGAM5途径介导AIFM1 Ser116的去磷酸化。通常与KEAP1/PGAM5/AIFM1轴相关，并最终导致DNA碎片化。
oER和线粒体的膨胀导致的细胞质空泡化。
oER腔内错折叠蛋白的积累导致渗透压力的产生，使得水分从细胞质中被抽走，造成ER扩张。
oER应激和扩张可促进从ER释放Ca2+，通过位于ER-线粒体轴的细胞内Ca2+通量机制导致线粒体Ca2+超载，进而引起线粒体扩张，最终造成细胞的死亡。
oEntosis 通常在细胞从细胞外基质(ECM)脱离时被触发，这种脱离状态常见于组织培养中的细胞，特别是当细胞过度生长导致接触抑制(Contact inhibition)。
oEntosis的激活主要受到了Rho GTPase家族成员，尤其是Rho和ROCK(Rho相关蛋白激酶)的控制。
·Erebosis这个术语来源于希腊语“erebos”，意味着完全的黑暗，是2022年新报道的一种肠上皮细胞自然更换过程中发现的新型细胞死亡形式。·Erebotic细胞经历膜泡沫化和肌动蛋白骨架的变化，最终导致细胞解体。·这一过程以细胞黏附力、细胞器的丧失，后续仍有待研究。
oMitoptosis由线粒体功能障碍和活性氧(ROS)的产生触发。
oMitoptosis的步骤包括线粒体的破坏损伤，形成线粒体纤维并在细胞核周围聚集，并形成一个膜来封闭这些线粒体簇，形成“mitoptotic body”，线粒体在此囊泡，体从细胞突出，最终破坏边界膜。
o而线粒体自噬并不涉及到Mitoptotic过程，并且在Mitoptosis过程中线粒体是先被破坏之后才形成Mitoptotic，并不会形成自噬小体，而线粒体自噬则更偏向于一个主动的过程，是通过自噬小体和溶酶体降解的。
·虽然凋亡、自噬与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。·细胞凋亡作为细胞主动结束生命的一种类型，在维持机体稳定的过程中起着非常重要的作用，其发生是受程序控制，逐步激活凋亡通路引起的，不产生炎症；细胞自噬是细胞内受损的细胞器或老化的蛋白质被细胞内溶酶体吞噬，是细胞的一种自我保护，通常会引发炎症；而细胞坏死往往是细胞急性结束生命的类型，会有细胞内含物释放到细胞外，进而导致炎症；三者都是细胞死亡的方式，但在起因、机制、细胞各部分形态等方面有很大的差异。
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