创伤精准修复 创伤精准修复 2024-06-05 17:12 浙江

细胞活死染色（Live-Dead Cell Staining）是一种用于区分活细胞和死细胞的实验技术，它主要基于活细胞和死细胞对特定染料的亲和力差异，利用染料与细胞内的不同成分发生特异性反应，从而使这些成分在显微镜下呈现出不同颜色和形态的技术。通过这种技术，研究人员可以清晰地观察到活细胞与死细胞，以及细胞内各种结构如细胞核、染色体、细胞器等的位置和形态。

细胞活死染色的原理基于活细胞和死细胞对特定染料的渗透性和反应性的差异。以下是细胞活死染色的主要原理：

（1）细胞膜完整性：活细胞的细胞膜是完整的，具有选择透过性，能够控制物质进出细胞。而死细胞的细胞膜受损，失去了其完整性，导致物质可以自由地进出细胞。

（2）染料渗透性：活死染色中使用的染料通常包括活细胞染料和死细胞染料。活细胞染料（如荧光素类染料）由于活细胞膜的屏障作用，不能自由进入活细胞内部，或者即使能进入，也会被活细胞内的酶分解或排出。而死细胞染料（如碘化丙啶PI）则能够穿透死细胞或受损细胞的细胞膜，与细胞内的DNA或RNA结合，从而发出荧光。

（3）荧光标记：许多活死染色方法使用荧光染料，这些染料在特定波长下会发出荧光。活细胞染料通常发出绿色荧光，而死细胞染料发出红色或其他颜色的荧光。这使得在荧光显微镜下可以直观地观察到活细胞和死细胞。

（4）代谢活性：一些活死染色方法还利用活细胞的代谢活性来区分活细胞和死细胞。例如，某些染料在活细胞内会被酶转化为荧光物质，从而发出荧光。而死细胞由于缺乏代谢活性，无法进行该转化。

综上，细胞活死染色原理是通过利用活细胞和死细胞对染料的渗透性和反应性的差异，以及荧光标记和代谢活性等方法，来区分活细胞和死细胞。细胞活死染色法在生物学、医学等领域的研究中具有广泛的应用价值。

（1）直观性：细胞活死染色可以直观地在显微镜下观察细胞的存活状态。活细胞与死细胞会显示出不同的颜色或荧光信号，使得研究人员能够直接区分活细胞和死细胞。

（2）快速性：许多活死染色方法操作简便，染色过程相对快速，能够在短时间内得到结果。这对于需要快速评估细胞活性的实验来说非常重要。

（3）高灵敏度：活死染色使用的染料通常具有很高的灵敏度，能够检测到极少量的细胞。这对于细胞计数、细胞凋亡研究等需要精确计量的实验来说至关重要。

（4）高特异性：活死染色方法通常具有很高的特异性，能够区分活细胞和死细胞，而不会对其他细胞结构或成分产生干扰。这使得实验结果更加准确可靠。

（5）多样性：细胞活死染色的方法多种多样，可以根据实验需求选择适合的染料和染色方法。例如，可以选择荧光染料进行荧光显微镜观察，或者选择化学染料进行流式细胞仪分析等。

（6）兼容性：活死染色方法通常与其他细胞生物学实验技术兼容，如免疫荧光、细胞培养等。这使得研究人员可以在同一组细胞中同时研究细胞的存活状态和其他生物学特性。

（7）无毒性或低毒性：许多活死染色方法使用的染料对细胞无毒或毒性较低，不会对细胞的正常生理功能产生显著影响。这对于需要长时间观察细胞活性的实验来说尤为重要。

（1） 准备细胞：如果使用的是贴壁细胞，先将细胞培养在适当的培养皿或培养瓶中，待细胞生长到合适密度后，进行后续操作。如果是悬浮细胞，则直接从培养液中收集细胞；

（2） 清洗细胞：移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞1 - 2次，以去除残留的培养基和血清，避免它们干扰后续的染色过程；

（3）配制染色工作液：根据所使用的活死细胞染色试剂盒中的说明，配制适当浓度的活细胞染料（如Calcein AM）和死细胞染料（如碘化丙啶PI）的工作液；

（4）染色：将清洗过的细胞与配制好的染色工作液混合，确保染料均匀覆盖细胞。在室温下避光孵育一定时间（通常为10 - 30 min），使染料充分进入细胞并与目标物质结合；

（5）再次清洗：孵育完成后，用PBS再次清洗细胞，以去除未结合的染料和背景干扰；

（6）观察：使用荧光显微镜或流式细胞仪等仪器观察细胞。活细胞会发出绿色荧光（或其他颜色，取决于所使用的活细胞染料），而死细胞会发出红色荧光（或其他颜色，取决于所使用的死细胞染料）；

（7）数据分析：如果使用的是流式细胞仪，可以收集数据并进行进一步的分析，如计算活细胞比例、凋亡细胞比例等。

（1）染色不均匀

可能原因：细胞密度不均；染色液浓度不合适；染色时间不足或过长。

建议：调整细胞密度，确保细胞均匀分布；根据染色试剂盒的推荐，配制合适浓度的染色液；严格控制染色时间，避免过长或过短。

（2）荧光信号弱

可能原因：染料过期；细胞活性差；荧光显微镜设置不当。

建议：使用新鲜的染料，确保其在有效期内；确保细胞在良好的生长条件下进行实验；调整荧光显微镜的参数设置，如激发波长、发射波长和曝光时间，以获得最佳的荧光信号。

（3）死细胞被误染为活细胞

可能原因：死细胞染料浓度过低；孵育时间不足；活细胞染料与死细胞发生非特异性结合。

建议：增加死细胞染料的浓度，确保足够的孵育时间；优化实验条件，减少非特异性结合的可能性；如有必要，可以尝试使用其他品牌的活死细胞染色试剂盒。

（4）活细胞被误染为死细胞

可能原因：活细胞染料浓度过高；孵育时间过长；细胞受到损伤或毒性物质的影响。

建议：降低活细胞染料的浓度，缩短孵育时间；确保细胞在健康的生长环境中进行实验；避免使用可能对细胞产生毒性的试剂或条件。

（5）背景信号过高

可能原因：染色液中的杂质、细胞碎片或培养基残留。

建议：使用高质量的染色液，避免使用过期或受到污染的试剂；在染色前彻底清洗细胞，去除培养基残留和细胞碎片；使用适当的荧光显微镜滤光片，减少背景信号的干扰。

（1）细阅读并遵循试剂盒说明书：不同品牌和类型的活死细胞染色试剂盒可能具有不同的操作要求和注意事项。确保按照说明书中的步骤进行操作，以获得准确可靠的结果。

（2）优化实验条件：根据实验的具体需求和细胞类型，优化细胞密度、染色液浓度、孵育时间等条件。通过预实验确定最佳的实验条件，可以提高实验的准确性和可靠性。

（3）注意细胞健康：确保细胞在健康的生长环境中进行实验，避免使用可能对细胞产生毒性或损伤的试剂或条件。健康的细胞更容易被准确地区分为活细胞或死细胞。

（4）使用高质量的试剂和仪器：选择高质量的活死细胞染色试剂盒、荧光显微镜和其他相关试剂和仪器。高质量的试剂和仪器可以提供更准确可靠的结果，并减少实验中的误差和干扰。

（5）记录实验过程和结果：详细记录实验过程中的每一个步骤和结果，包括使用的试剂、浓度、孵育时间、荧光显微镜设置等。这有助于分析实验结果并找出可能的问题所在。

如图显示了在不同微载体中培养1、3和5天的活/死rADSCs。所有微载体均显示大量活细胞和少量死细胞，这进一步表明多孔微载体有利于细胞生长，并且它们是用于三维（3D）细胞扩增和递送的理想微载体。此外，与纯CS微载体相比，CS-PTL和CS-PTL-Mg复合微载体中的活细胞明显更多。

通过纤维支架与细胞共培养和细胞黏附于纤维支架两种方法研究纤维植入物对HGFs细胞活性的影响。观察到细胞倾向于沿着纤维的方向排列，在F0 - F4支架上培养的HGFs细胞表现出良好的生物相容性，且支架之间没有显著差异。

由图可见，所有处理组的BMSC大多呈存活状态，且均能确保95%以上的HUVECs、巨噬细胞存活，表明其具有良好的生物相容性。

结果显示在第1天和培养1周后所有细胞类型皆呈现高细胞活力（>90%）。并且MFCs和MSCs在培养7天后表现出一些特征性的扩散行为，而软骨细胞保持圆形。

Calcein AM/PI活细胞和死细胞染色显示，Hst1@CBTC（50和100 μM）组的活细胞比例与对照组相当，表明氧化应激HaCats的增殖得到改善。

活死染色是一种重要的生物学实验技术，可以用于区分活细胞和死细胞，主要有台盼蓝染色法、荧光染色法、美蓝染色法及细菌活死染色。活死染色技术广泛应用于生物学、医学、生物技术等领域。例如，在细胞培养过程中，可以使用活死染色技术来监测细胞的生长和死亡情况；在药物筛选和毒性评估中，可以通过观察细胞对药物的反应来评估药物的疗效和安全性；在肿瘤研究中，活死染色技术还可以用于评估肿瘤细胞的增殖和凋亡情况等。