生物屋 2024-03-12 13:08 上海

[细胞因子概述]

·细胞因子(Cytokine)是一类由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)在受到刺激后合成和分泌的小分子蛋白质，具有广泛的生物学活性。

·细胞因子分为促炎性和抗炎性两种。细胞因子具体分类请参考免疫学基础知识(九)：细胞因子概述

·促炎细胞因子由Th1细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞和树突状细胞分泌，包括有IL-1(IL-1α、IL-1β)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-33、LIF、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。

·关键的促炎细胞因子是IL-1(IL-1α、IL-1β)、IL-6和TNF-α。

·这些促炎细胞因子通过I型细胞因子受体(CCR1)发出信号，该受体在结构上与其他细胞因子受体类型有所不同。它们紧密调节细胞介导的免疫反应，在调节免疫系统中发挥着重要作用。

·促炎细胞因子通常调节免疫细胞的生长、活化、分化以及归巢至感染部位，最终控制并根除细胞内病原体(包括病毒)。

·抗炎细胞因子是一系列控制促炎细胞因子反应的免疫调节分子，细胞因子与特定的细胞因子抑制剂和可溶性细胞因子受体协同作用以调节人体免疫反应，抗炎细胞因子在炎症中的生理作用和在全身性炎症状态中的病理作用被广泛认可。

·关键的抗炎细胞因子包括IL-1受体拮抗剂、 IL-4 、 IL-10 和 IL-13。

表 1.细胞因子及其功能概述

[细胞因子检测技术]

·目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测技术大致包括免疫学方法、分子生物学方法及质谱法。

·基于免疫学的检测方法：炎症因子作为一种蛋白质抗原，可以特异性与其单克隆抗体结合，利用抗原-抗体反应检测细胞因子，近年来发展比较快，其方法包括Western Blot、IF、ELISA、FCM、CBA、ELISpot、MSD技术、Luminex技术、Olink技术、Simoa技术等。

·基于分子生物学方法：主要是检测细胞因子的基因表达水平，包括对其DNA的检测和mRNA表达水平的检测。对于表达低或者体内只能得到数量极少的细胞产生的细胞因子，因其含量太低，免疫学和生物学方法难以测定，常用的方法有Southern印迹、斑点印迹、PCR，原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及RT-PCR。

·Western Blot (WB)

oWestern Blot (WB)是一种熟知的蛋白质印迹法/免疫印迹实验，是一种常规的蛋白分析技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

oWB实验的基本核心理念是抗原-抗体的特异性反应，通过变性胶SDS-PAGE将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到固相载体硝酸纤维素薄膜(NC)或聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后，用洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗，加入带有标记的对应二抗，这样，目的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的位置就会产生荧光，利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。

oWB有现成试剂盒，使用者只需要按照试剂盒的操作步骤完成即可，其特异性、重复性及精密性较好，可实现pg级别的绝对定量。

oWB可用于蛋白质表达水平的测定、细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰等研究，可实现蛋白的定性和相对定量(半定量)，而且可以看到蛋白的分子量大小。只要抗体可用，该方法可广泛应用于人、动物、植物等多个物种的研究中。

o本质原理上ELISA和WB都可以，但炎症因子作为蛋白质，存在浓度级的问题，太低了检测不到，或者不能真实反映，所以细胞分泌的炎症因子一般不能用来跑WB。

·全自动毛细管 Digital Western

o作为创新性毛细管电泳免疫学技术，全自动毛细管Digital Western(也称Simple Western)将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，具备传统WB蛋白质可视化定性优势，同时具备ELISA免疫学实验精准定量能力，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求，可利用超微量样本实现内源性蛋白质精准定量。

o自动化规避了传统WB和SDS-PAGE劳动密集型操作引入的人为误差，仅需要微量样本(3 μL)即可实现多重蛋白质表达检测，节约珍贵样品，例如，外泌体、分选干细胞、显微切割、类器官、生殖细胞等。全程试验无人值守，3小时即可获取25个实验样品数据。可精准定量，覆盖从体外细胞水平到体内组织水平实验，建立药物与蛋白质表达水平的量效关系和时效关系曲线。

·免疫荧光法IF

o免疫荧光法(Immunofluorescence, IF)是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原/细胞因子在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。

o利用激光共聚焦显微镜观察标记的抗体与细胞因子结合的情况，适用于定量和定位分析。

o该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。

o主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

·ELISA

o酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术。

o固定在载体表面的抗原或者抗体不会失活，仍然保留其免疫反应性，酶标记的抗体或者抗原既具有免疫学活性，还具有酶的催化活性。

o在实际检测时，首先将抗原或者抗体固定在固相载体上，然后加入检测对象，让待测物质与固相化物质结合，形成固相化的“抗原-抗体”复合物；再加入酶标记的抗体或者抗原，与固相化的复合物结合，形成酶标复合物，最后加入底物溶液，发生酶催化底物显色反应，根据颜色深浅进行定性或定量分析。

oELISA有不同形式，包括直接法ELISA、间接法ELISA、夹心法ELISA和竞争法ELISA。

o最常用的是夹心法ELISA，它可以直接检测分泌到细胞外的处于游离状态的细胞因子，灵敏度高、操作简单、经济实惠，实验室配备一台酶标仪就可以完成整个实验。

·全自动微流控 ELISA

o全自动微流控免疫分析平台克服了传统ELISA技术手动操作步骤多、时间长、样本量大、重复性差和结果不可靠等局限。

o利用创新的微流控卡盒，全自动生物标志物检测平台可快速获取高质量数据结果，同时可对多种生物标志物进行多通道同步检测。

o其检测原理如下图所示，特异性捕获抗体包被在纳米级微量反应管(Glass Nano Reactor，GNR)中，再将GNR嵌入微流控管路内。相关的抗体对和试剂已经被预先包被在卡盒中，并且经过严格验证，卡盒拿来即用，方便快捷。卡盒出厂内置标曲，无需制作标准曲线。微流控ELISA平台可自动取样本和检测，最后自动输出2~3个平行GNR的数据及均值。

o传统的多重检测可能会出现交叉反应和干扰，从而降低数据质量，而微流控ELISA可将待测样本分配到四个平行的微流控管路中，同一管路内最多只进行两重检测，从而消除交叉反应信号串扰的问题。

·ELISpot

o酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISpot)是一种定量和定性的实验，基于夹心ELISA免疫分析原理，旨在计数细胞因子分泌细胞。它的灵敏度极高，因此在检测低量细胞因子分泌细胞(1/300000)方面非常有效，对抗原的细胞因子释放可以映射到单个细胞，因此可以计算T细胞应答频率。

o细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISpot酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。该技术可以在单细胞水平对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测，能从20-30万个细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。

o该方法关注的结果是分泌细胞的比率(等于阳性细胞数/总细胞数)，主要用于疫苗、细胞治疗、基因治疗等领域，是研究T细胞免疫原性反应的主要检测方法。

oELISpot通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。而ELISA则通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

o该方法的样本要求是活细胞，其中细胞存活率最好不低于80%，如果能达到90%以上更好。

oELISpot法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。

·MSD

o超敏电化学发光技术(Meso Scale Discovery, MSD)是基于石墨微孔板的电化学发光免疫分析，它是根据ELISA基本原理的升级，在板底通电从而激发标记物SULFO-TAG发光并由CCD Camera进行信号采集。

o主要基于超敏多因子电化学发光分析仪MESO Sector 600或Quickplex SQ 120，通过点阵技术，在96孔石墨电极板里可实现10个指标每孔的检测，也可在24孔板里定制实现100指标/孔的筛选检测。

oMSD系统的灵敏度略高于流式细胞仪(CBA)系统，可以定量自然细胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IL-12p70、IL-1β)的循环水平，并准确回收添加到血清样本中的已知数量的重组细胞因子。

oMSD是一种电化学发光法，用于检测细胞因子、蛋白质、抗体和核酸等生物分子，属于第三代免疫分析技术。

·Luminex液相芯片检测技术

oLuminex技术是结合微球和流式细胞仪的原理来检测蛋白的一种方法，核心是将聚丙乙烯微球或者磁性微球用荧光染料的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多100种具有不同荧光光谱的微球，每种微球共价交联上针对特定抗原的捕获抗体。

o应用时，先将针对不同检测物的微球混合，加入待测样本后，靶分子与微球表面的捕获抗体特异结合，每个反应孔中可同时完成最多100种检测反应。上机时仪器通过两束激光分别识别微球的编码和微球上报告分子的荧光信号强度，荧光强度反应微球结合的靶标蛋白的含量，这一步用于定量。因此，利用微球技术，可以同时检测多个蛋白。

oLuminex技术类似多重ELISA检测，也可以实现pg级别的绝对定量，可以检测细胞因子、趋化因子、转录因子和生长因子等260多种蛋白和数以千计基因表达情况，而且一次可以检测多种蛋白指标。

·PEA (Olink平台)

o临近延伸分析技术(Proximity Extension Assay, PEA)是通过一对特异性抗体结合识别靶蛋白，这对抗体分别偶联DNA寡核苷酸标记，当结合在同一蛋白上的两个抗体相互靠近时DNA寡核苷酸互补配对并结合DNA聚合酶进行扩增。最后，使用qPCR或二代测序技术定量DNA寡核苷酸，通过特异性的核苷酸序列信号来反应检测蛋白质的含量。

oPEA能够利用微量的血清、血浆或几乎任何其他类型的生物样本进行高通量、多重免疫检测。

o其检测原理基于抗体免疫分析和PCR或二代测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术，96个寡核苷酸抗体对中的每一对都包含唯一的DNA序列，只允许彼此杂交，随后的邻近延伸将创建96个唯一的DNA报告序列，这些序列将通过实时PCR进行扩增。多重免疫测定的限制因素是抗体的交叉反应，这会将大多数测定的多重测定程度限制在10重以下。但是该技术不会检测到交叉反应，无串扰，因为只有匹配的DNA报告对才能够杂交以产生用于NGS或实时qPCR的扩增子，这允许进行可扩展的多重测定而不损失特异性和灵敏性。

oOlink技术检测限可达飞摩尔(fg/ml)数量级，具有高通量、高灵敏、低体积、宽动态、支持液体活检及多样本形式、自动化样本处理流程提供绝佳的简易性、准确性及重复性，可用于疾病预测、病例分层、诊断及预后、筛选疾病标志物、药物靶点等基础研究。

·单分子免疫阵列技术 SiMoA

o单分子免疫阵列技术(Single Molecule Array, SiMoA)基于微阵列芯片单分子免疫检测，是在毫米级芯片上雕刻(或浇筑)成千上万个微米级微井，每个微井体积约40 fl左右，随后将免疫复合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数，依据泊松分布理论，计算同时含Bead与荧光产物孔的数量/含Bead孔总数的比值，以此确定测试样品中的蛋白质浓度。

o其原理就像是在一个微小的反应容器(微井)中放大信号，微井把待测物和检测抗体捕捉在一个特定区域内，形成一种单分子级别的反应环境。这个微小的反应容器不仅能够隔离待测物，还能够增强信号，使能够观察到微小到单分子水平的事件。当目标分子与检测抗体结合时，引入荧光或其他标记物，产生可观测的光信号。单分子免疫阵列技术的灵敏度非常高，能够检测到极低浓度的分子，使得对罕见或微量分子的检测成为可能。

oSiMoA技术灵敏度高，与Olink技术同为目前具代表性的单分子免疫检测技术。实现了超低丰度蛋白的有效检测和定量，为低丰度炎症因子的实时监控提供了技术支撑，专注于神经、免疫&肿瘤、心脏病、传染病、炎症等生物标记物检测应用领域。

·流式细胞术(FCM)胞内染色法

o细胞因子是由细胞合成和分泌的，ELISA只检测分泌到细胞外的细胞因子，新合成的细胞因子怎么检测呢？流式细胞术胞内染色法(Flow cytometry intracellular staining)便可以做到。

o通常情况下，获得需要的单细胞悬液后，经激活和通透处理之后，达到胞内染色检测细胞因子的浓度阈值，进行胞内细胞因子染色，最后可检测到合成细胞因子的阳性比例。流式细胞术胞内染色法和ELISA方法互为补充，一般只有在两种方法都得到阳性结果时，才能得出肯定的结论。

o由于细胞因子通常是分泌蛋白质，必须首先使用蛋白质运输抑制剂将其捕获在细胞内。两种最常用的蛋白转运抑制剂为莫能菌素(Monensin, BD GolgiStop™抑制剂)和布雷菲德菌素A(Brefeldin A (BFA), BD GolgiPlug™抑制剂)。莫能菌素可与高尔基体跨膜Na++/H+转运相互作用阻止蛋白质的分泌，而布雷菲德菌素A将细胞内分泌的蛋白质从cis/高尔基体中间复合物重新分配到内质网。因此，蛋白质转运抑制剂的最佳选择因细胞因子和物种而异(下表)。

o流式细胞术胞内染色法可以很容易地确定活化细胞群分泌的细胞因子是少数细胞分泌大量细胞因子的结果，还是大量细胞群每个细胞分泌少量细胞因子的结果。

o流式细胞术胞内染色法可便于同时测量多种细胞因子，以识别多功能细胞。细胞内细胞因子染色对多种研究都有用，包括B细胞和T细胞的分化和可塑性。

·流式细胞术(FCM)胞外染色法

oCytokine Secretion Assay-Detection kit是一种美天旎细胞因子分泌型细胞检测试剂盒，专为高灵敏度地检测分泌细胞因子的细胞而研发的。独特的技术优势使其可以检测活细胞分泌细胞因子的情况，并且对细胞的标记兼容下游应用，如细胞分选和培养。该试剂盒适用于刺激剂(例如多克隆刺激剂，CytoStim、抗原多肽、蛋白质等)刺激后，抗原特异性CD4+T细胞和CD8+细胞的检测和研究。

o多克隆刺激剂刺激T细胞3-16小时，T细胞活化；捕获试剂与细胞共孵育，捕获试剂的一端耦联CD45抗体，所有白细胞都被捕获试剂标记，捕获试剂另一端耦联细胞因子特异性抗体；抗原特异性T细胞分泌细胞因子，分泌的细胞因子将被捕获试剂所结合；加入细胞因子特异性的检测试剂，耦联荧光素的细胞因子抗体将与细胞因子，捕获试剂形成带荧光的三明治复合物，即可用流式进行检测。

o无需破膜固定，即可检测活细胞分泌细胞因子的情况，并且标记的细胞适用于分选及分选后培养。

·微球免疫分析技术 CBA

o微球免疫分析技术CBA (Cytometric Bead Array，CBA)即流式编码微球芯片技术，又称细胞因子微球检测技术，是用流式细胞仪对多重蛋白进行定量检测的方法，能够同时对样本中的多个指标进行定性、定量检测，可应用于细胞因子检测。

oCBA是基于流式细胞术(Flow Cytometry)的原理，使用微米级荧光标记的Bead，每种Bead上带有特定抗体，这些抗体能够与感兴趣的细胞因子相结合。Bead被混合在待测样本中，每种Bead具有不同的荧光信号，以便后续流式细胞仪的检测和区分。

o样本中的目标细胞因子或蛋白质与Bead上的相应抗体结合，形成免疫复合物。通过洗涤步骤去除未结合的成分，确保只有与抗体结合的Bead被保留。荧光标记的二抗被引入系统后，与免疫复合物中的抗体结合，从而标记了被检测的分子。Bead和样本经过混合和处理后，使用流式细胞仪来分析每个Bead的荧光信号。通过测量Bead的荧光强度，可以确定样本中特定蛋白质或细胞因子的浓度。

oCBA法的优点是同时可以进行多参数检测，快速并且信息量大，其优势体现在能够同时对单个样本进行多种检测，所需样本量少、灵敏度高、稳定性好等。

·电化学发光

o电化学发光(Electrochemiluminescence, ECL)是基于ELISA基本原理的一种技术，使用96/384微孔板中(采用石墨材质，背面带有电路)作为底板，捕获抗体形成夹心复合物。

o待测样本和三联吡啶钌标记的检测抗体加入后，微孔板被置于电化学发光检测仪器中，通电后发生化学反应，使[Ru(bpy)₃]³⁺转变为[Ru(bpy)₃]²⁺，然后再还原为[Ru(bpy)₃]³⁺，形成循环反应。在此过程中，释放的光子(波长620nm)由检测仪器中的CCD相机捕获，其释放量与待测物的浓度成正比。多个激发周期可以放大信号，提高了检测灵敏度。

·反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

o即将RNA的反转录(Reverse transcription)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原理是首先以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。然后以cDNA为模板，用PCR技术对靶序列进行扩展，使微量细胞因子的RNA经放大后检出。

o该方法尤其适用于含量极少或容易降解的细胞因子，无视样本类型，只需要设计好相对性的扩增引物及探针。但易出现假阳性和假阴性，在实验中必须设严格的对照实验。且测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平，并且不容易对细胞因子表达水平进行定量。

·质谱法

o 即用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。

o 因为质谱仪器的种类多，应用范围广，其检测灵敏度极高，但目前主要用于细胞因子检测的方法有待进一步开发，市面上主要存在靶向蛋白质组学(PRM)方法和非靶向蛋白质组学方法。

o PRM检测法最多一次可检测50种蛋白质进行绝对/相对定量，非靶向蛋白质组学方法最多一次可检测多达数千种蛋白质进行绝对/相对定量，但重复性稍差，要严格控制操作条件。此外，生物样品的前处理方法跟检测结果的准确性息息相关。

[细胞因子检测技术的比较]

7种常用细胞因子检测方法比较

参考文献

1.https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/immunology-at-work/proinflammatory-cytokines-overview.html

2. https://cn.sinobiological.com/resource/cytokines/proinflammatory-cytokines

3. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247-258. doi: 10.1038/nri2274

4. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor alpha in monocytes. Cytometry. 2001;46(3):172-176. doi: 10.1002/cyto.1102

5. https://www.188bio.cn/b98/tech-1381874200.html