一、活性氧（ROS）介绍
活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是机体进行正常有氧代谢的产物，是由氧组成，含氧并且性质活泼的一类物质的总称。包含超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）、臭氧（O3）和单线态氧（1O2）等，由于它们含有不成对的电子，因此具有很高的化学反应活性。
在机体内，ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，在线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给O2的过程中，有一部分O2被还原，形成O2-或H2O2。其中，最为重要的是O2-，它是大部分的ROS的前体，主要由线粒体内膜呼吸链中的蛋白酶复合体Ⅰ、Ⅲ产生。这部分作为代谢副产物的ROS长期被当作损伤生物大分子的毒性分子，但近年来被认为在较低水平时作为一类信号小分子具有生理作用。另一个ROS的重要来源是NADPH化酶，其催化亚基被称为NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能够在细胞质膜上表达。这些酶能通过质传递电子产生ROS，可以大量存在于吞噬细胞，也在其他各种组织细胞中以较低水平普遍存在，参与很多膜受体下游信号激活。
图1 ROS主要来源（Arfin et al., 2021）。
二、为什么要测活性氧（ROS）？
正常情况下，ROS作为氧代谢的天然副产物，在机体内处于较低的水平，作为“氧化还原信使”参与细胞内的信号传递和调节，并且在细胞周期、基因表达和机体内环境稳态的维持中发挥着重要作用。然而，当机体受到刺激时，如紫外线、辐射、缺氧、热暴露等，ROS水平会急剧增加，超过机体本身的清除处理能力，机体氧化-抗氧化作用失衡，发生氧化应激，从而导致DNA损伤，脂质过氧化，蛋白结构和功能发生改变，细胞膜被破坏，最终引起机体细胞的死亡。此外，这些大分子物质的损伤还与癌症、衰老、炎症和多种人类疾病（神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病）等的发病机制有关。
ROS水平是细胞正常生理功能和环境因素导致的细胞氧化损伤的重要标志，因此，非常有必要对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量，检测细胞内ROS水平对于理解细胞信号转导和研究疾病潜在作用机制具有重要意义。
图2 2010-2023年ROS文章统计（来源于Medeading）。
三、活性氧（ROS）的检测方法
目前针对ROS的检测方法有荧光染色法、电子顺磁共振技术(EPR)、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器和基于荧光蛋白等7种方法，今天主要讲解一下荧光染色法检测细胞内ROS的原理及操作步骤。
四、检测原理
目前利用荧光染色法检测细胞内ROS最常用的是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA（Dichlorofluorescein Diacetate，2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐）是一种可指示的探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通过细胞膜，因此探针很容易积聚在细胞内。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，且绿色荧光的强度与ROS的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析细胞内活性氧的真正水平。
图3 DCFH-DA探针在细胞内的作用机制（Rajneesh et al., 2017）。
五、实验流程
1.装载探针
1）先用无血清培养基稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，对于刺激时间较短的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照（Rosup）或自己感兴趣的药物刺激细胞。
2）对于刺激时间较长的细胞，先用活性氧阳性对照（Rosup）或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
1.1原位装载探针（本方法仅适用于贴壁细胞）
1）细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞密度达到50~70%。
2）诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据诱导物本身特性，以及细胞类型来决定。
3）探针装载：按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。吸去诱导用药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液，以覆盖住细胞为宜。
4）细胞清洗：用无血清培养基洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
1.2收集细胞后装载探针（适用于贴壁细胞和悬浮细胞）
1）细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测所用细胞状态健康。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
2）诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据诱导物本身特性，以及细胞类型来决定。
3）探针装载：离心去除上清，收集细胞，加入浓度为10μM的DCFH-DA探针，以覆盖住细胞为宜。
4）细胞清洗：用无血清细胞培养基洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2.检测
1）原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
2）收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
六、注意事项
1）探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2）探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3）尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
参考文献
Arfin S, Jha NK, Jha SK, et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021;10(5):642. Published 2021 Apr 22.
Rajneesh, Pathak J , Chatterjee A , et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio-Protocol, 2017, 7:2545.
