神经退行性疾病（NDs）随着预期寿命的增加而恶化，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和亨廷顿病（HD）等[1]。这些疾病的共同特征包括特定神经元的选择性神经退行性变。NDs的选择性神经退行性变与受影响脑区错误折叠蛋白的积累密切相关，这主要是由于清除衰老神经元中有害和有毒蛋白或肽的细胞机制受损。到目前为止，还没有一种有效的治疗方法来减缓、停止或预防任何NDs。治疗方法主要是口服营养脑细胞的药物、抗炎症因子的药物、增强体质锻炼的药物等，以及加强护理，延缓病情进展。动物模型对于研究NDs的发病机制和发展其治疗方法至关重要。本文我们来介绍NDs不同动物模型构建方法及优缺点。
NDs的动物模型主要有啮齿动物、斑马鱼、非人灵长类动物等。
啮齿动物模型的优缺点：啮齿动物的寿命相对较短，更容易快速繁殖，成本更低，具备可用的基因编辑技术，已经建立完善的行为测试方法。然而，大多数啮齿动物模型未能再现患者的明显和典型性神经退行性变。
斑马鱼模型的优缺点：斑马鱼拥有脊椎动物的神经结构组织，主要结构都与哺乳动物的大脑相似，具有与人类类似的功能性血脑屏障。斑马鱼生命周期短、繁殖力高，特别适合于大规模药物筛选[2]。
非人灵长类动物的优缺点：大脑发育、解剖结构、认知和行为复杂性方面与人更接近，大脑比小型动物要大得多并且具备皮质表面的折叠，与人的基因相似性更大，病理发展更类似，具备疾病评估的可用性，但是动物繁殖周期长，价格昂贵，基因修饰技术不够完善[3]。
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目前热门的动物模型突变基因包括APP、PS1、MAPT、BACE、APOE等，常用的AD疾病的动物模型有APP/PS1、3×Tg、5×FAD等。
APP/PS1双转小鼠：两种表达质粒被构建（Mo/HuAPP695swe和PS1-dE9），基因表达均由独立的小鼠朊病毒蛋白（PrP）启动子元件驱动，在中枢神经系统神经元中特异性表达。将两种构建体等量共注射到（C57BL/6xC3H）F2原核中，在单个位点插入转基因。获得了转基因品系85，其种群以半合子维持。
3×Tg三转小鼠：将等摩尔量的两个独立突变人类转基因（APPSwe和tauP301L）构建体共注射到来自纯合PS1M146V基因敲入小鼠的单细胞胚胎的原核中。PS1敲入小鼠最初是作为129/C57BL6杂交背景产生的。通过尾部DNA的Southern印迹分析鉴定转基因小鼠。将创始小鼠与亲本PS1敲入小鼠回交。杂交后代进行交配可获得三个等位基因都纯合的小鼠（3×Tg AD）。3×Tg小鼠首先在3-4个月时出现神经元内Aβ，然后在大约6个月时在皮质和海马体中出现斑块。神经原纤维缠结（NFT）在大约12个月时形成。
5×FAD五转小鼠：结合三个人类APP突变体（APPK670N/M671L、APPV717I和APPI716V）和两个PS1突变（PS1M146L和PS1L286V）建立，将三个位点突变的APP cDNA序列和两个位点突变的PS1 cDNA序列分别插入到小鼠Thy1基因的2号外显子中。两个转基因构建体共注射到单细胞“C57/B6XSJL”杂交胚胎的原核中。将来自APP表达水平最高的首建鼠（Tg6799）与（B6/SJL）F1小鼠杂交超过10代，具有稳定的种系传递和两个转基因的表达。5×FAD小鼠在6周时早期神经元内Aβ积累，在2个月时形成斑块。
化学诱导
基于神经毒素的模型诱导黑质纹状体多巴胺能神经元的快速变性，模拟散发性帕金森病，如6-羟基多巴胺（6-OHDA）、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）、百草枯和鱼藤酮。
6-OHDA造模方法：将8周龄雄性C57BL/6小鼠置于立体定向装置中，以30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，将6 μg 6-OHDA（在2 μL含0.02%抗坏血酸的生理盐水中）注射到右侧脑纹状体、黑质或前脑内侧束，术后3天内每天腹腔注射一次抗生素，3-4周可以进行行为学检测。6-OHDA模型并不能完全模拟PD的病理特征，因为其缺乏路易小体（LB）的形成。
MPTP造模方法：8周龄雄性C57BL/6小鼠（体重25-30g）每天腹腔注射一次MPTP（30mg/kg，溶于0.9％盐水），连续5天，这种治疗诱导了黑质纹状体多巴胺能系统的“延迟变性”，包括位于黑质致密部的多巴胺能神经元的细胞凋亡。
鱼藤酮造模方法：8周龄雄性C57BL/6小鼠（体重20-25g）每天口服一次鱼藤酮，剂量为30 mg/kg，鱼藤酮悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠盐中，体积为5 mL/kg，持续56 d。56 d可导致酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的显著损失和行为障碍。
基因编辑
研究已经发现了一些家族性PD相关基因，如SNCA（α-突触核蛋白）、parkin、DJ-1、PINK1和LRRK2，基于这些基因可以构建转基因动物模型[4]。
A53T小鼠：A53T转基因小鼠在鼠源朊蛋白启动子调控下表达人源α-突触核蛋白A53T突变。品系建立是将包含小鼠朊蛋白启动子、5’和3’非编码区和人源SNCA A53T突变cDNA序列的转基因构建体注射到B6C3H小鼠受精卵中。转基因动物维持在B6C3H混合遗传背景下，维持活体种群的方法是将纯合小鼠与半合小鼠交配繁育。
DJ-1基因敲除小鼠：DJ-1突变与隐性家族性帕金森病有关，DJ-1是一种抗氧化蛋白，有助于对抗DA神经元的氧化环境。使用CRISPR/Cas9技术对Park7基因进行了修饰，gRNA在体外转录。将Cas9和gRNA微注射到C57BL/6JGpt小鼠受精卵中。移植受精卵获得F0阳性小鼠，经PCR和测序证实。将F0代阳性小鼠与C57BL/6JGpt小鼠交配，获得稳定的F1代小鼠模型。
PINK1基因敲除鼠：PINK1的突变与隐性帕金森病相关，PINK1是一种神经保护激酶，主要存在于线粒体和胞质隔室中，并在神经元分化中发挥作用PINK1。该基因动物模型通常不表现出典型的PD病变—突触核蛋白沉积。Pink1位于小鼠的4号染色体，采用CRISPR/Cas9技术，设计sgRNA，通过应用高通量电转受精卵方式，获得Pink1基因敲除小鼠，性成熟后取精子冻存。
表1 不同动物模型在帕金森病研究中的优势和局限性总结[5]
与大多数散发性的AD和PD病例不同，HD是一种由单基因突变引起的遗传性神经系统疾病，这使得利用遗传操作开发动物模型成为可能。这些模型包括表达人类突变体HTT氨基末端区域的转基因小鼠R6/2和N171-82Q；表达全长人类突变体HTT转基因小鼠，如酵母人工染色体小鼠（YAC128）和细菌人工染色体小鼠（BACHD），以及将小鼠HTT基因的第一个外显子替换为含有扩展CAG重复序列的人类HTT基因的第一个外显子产生的敲入小鼠，如HdhHQ97/Q97、HdhQ111/Q111和HdhQ150/Q150。
动物模型为理解NDs的病理生理学提供了重要的贡献。由于NDs在病理和临床（或行为）上都是异质性的，动物模型只概括了这一复杂情况的一部分。此外，遗传或转基因动物模型已广泛应用，大多数人类AD和PD病例是散发性的，而不是家族性的。这些方面可以共同解释动物模型对发展有效的疾病治疗策略的贡献是有限的。目前，还没有一种通用的模型能够反映神经退行性变等复杂过程的所有方面。因此，建议依据课题目标使用合适的动物模型。
参考文献：
[1] Hou Y, Dan X, Babbar M, Wei Y, Hasselbalch SG, Croteau DL, et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature reviews Neurology 2019, 15(10): 565-581.
[2] Wang J, Cao H. Zebrafish and Medaka: Important Animal Models for Human Neurodegenerative Diseases. International journal of molecular sciences 2021, 22(19).
[3] Lanyon-Hogg T, Faronato M, Serwa RA, Tate EW. Dynamic Protein Acylation: New Substrates, Mechanisms, and Drug Targets. Trends in biochemical sciences 2017, 42(7): 566-581.
[4] Dawson TM, Golde TE, Lagier-Tourenne C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature neuroscience 2018, 21(10): 1370-1379.
[5] Chia SJ, Tan EK, Chao YX. Historical Perspective: Models of Parkinson's Disease. International journal of molecular sciences 2020, 21(7).
